人群 TWAS 扫描
目的：从遗传层面筛选与 PAH 显著相关的可表达基因。
方法：利用 FinnGen R11 316 622 例汇总数据（277 PAH/316 345 对照），FUSION 软件跨 49 种组织进行表达插补与关联检验。
结果：115 个基因 P<0.01，富集 IL-17、FOXO、泛素化等通路，为下游单细胞分析提供基因列表。
scRNA-seq 数据获取与质控
目的：构建高质量单细胞图谱。
方法：GEO 下载 GSE169471 & GSE210248，共 17 例样本；Seurat 过滤线粒体<20%、基因数 200–7000，最终 44 647 细胞。Harmony 去批次。
结果：获得 21 个稳定聚类，注释为内皮、巨噬、T/NK、成纤维等 12 种主要细胞类型。
单细胞 TWAS 活性评分
目的：量化每个细胞中 PAH 遗传危险信号的转录活性。
方法：采用 AUCell、UCell、ssGSEA、AddModuleScore 四种算法，对 115 个 TWAS 基因集进行单细胞打分；Z-score+Min-Max 标准化后求和得综合评分。
结果：内皮细胞综合评分显著高于其他细胞；评分呈正态分布，可四分位划分 LTS/MTS/HTS。
HTS 亚群鉴定与组织偏好
目的：明确高遗传危险信号细胞的表型特征与样本来源偏好。
方法：按 75% 分位数切点定义 HTS；Ro/e 比值、MiloR 差异丰度检验。
结果：HTS 显著富集于 PAH 样本（31.5% vs 21.1%），提示疾病特异性扩张。
干细胞潜能与拟时序分析
目的：判断 HTS 是否具备祖细胞/去分化特征。
方法：CytoTRACE（转录多样性指标）、Slingshot & Monocle2 轨迹推断。
结果：HTS CytoTRACE 评分最高，位于拟时间起始端，提示其处于更原始的分化状态，可能驱动血管重塑。
细胞间通讯与代谢特征
目的：解析 HTS 如何重塑微环境。
方法：CellChat 构建配体-受体网络；scMetabolism 计算 85 条代谢通路活性；GSVA 富集 hallmark。
结果：HTS outgoing 信号（SPP1、MIF、VEGF 等）显著增强；TGF-β、顶端连接、凝血通路激活；糖酵解、脂肪酸氧化等代谢通路重编程。
机器学习特征基因筛选
目的：从 115 个 TWAS 基因中提炼可区分 HTS 的极简分子标志。
方法：7 种算法（LASSO/RF/XGBoost/Boruta/GBM/ABESS/DT）分别做二分类（HTS vs LTS），取交集。
结果：一致锁定 3 基因——KLF2、RASIP1、
DEPP1。
模型基准测试与诊断效能
目的：评估三基因对 HTS 状态的预测能力及算法稳健性。
方法：9 种分类器（mlr3 框架，内 5 折调参、外 10 折验证），绘制 ROC、PR 曲线；单基因 ROC 对比。
结果：随机森林平均 AUC 最高（0.862）；单基因 AUC 0.66–0.74，三基因联合显著提升精度。
特征基因表达与功能关联
目的：验证三基因在单细胞及 bulk 水平的表达差异，并解析 KLF2 的功能角色。
方法：Wilcoxon 比较 PAH vs 对照；Pearson 相关分析 KLF2 与 TWAS 评分；CellChat 比较 KLF2+ vs KLF2− 内皮细胞的通讯强度。
结果：三基因在 PAH 内皮显著高表达；KLF2 与 TWAS 评分高度正相关（r>0.7）；KLF2+ 内皮与单核/巨噬 MIF 信号增强，可能促进炎症与异常血管生成。
动物模型验证
目的：在体内确认三基因随 PAH 病程上调。
方法：慢性缺氧（10% O₂，5 周）诱导小鼠/大鼠 PAH；超声测 PAT、导管测 RVSP；qRT-PCR 与 IHC 检测肺组织表达。
结果：缺氧组 RVSP 升高、RV 肥厚指数增加；肺小动脉内膜增厚；KLF2、RASIP1、DEPP1 mRNA 与蛋白均显著升高，与血流动力学指标正相关。
